(本中文說明書為翻譯稿，僅供參考，應(yīng)以英文版為準(zhǔn))

貨號(hào)：3091315 (Sigma-Aldrich : GAHK20)

儲(chǔ)存溫度：2-8℃

產(chǎn)品描述：

作為分析工具的酶已在食品，生化和制藥行業(yè)中得到廣泛使用。酶法具有特異性高，可重現(xiàn)性好，靈敏度高，反應(yīng)快速的特點(diǎn)，因此是分析的理想選擇。由于酶的高度特異性和敏感性，因此可以在幾乎沒有樣品制備或沒有樣品制備的情況下，對(duì)粗物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定食品和其他材料中的葡萄糖。

葡萄糖(HK)檢測(cè)試劑盒用于食品和其他材料中葡萄糖的定量、酶法測(cè)定。該試劑盒已應(yīng)用于不同的系統(tǒng)以進(jìn)行與下列課題有關(guān)的研究：

·HEK細(xì)胞中的肝葡萄糖和脂質(zhì)平衡⁴

·產(chǎn)婦肥胖模型⁵

·纖維素酶燃料電池轉(zhuǎn)化⁶

原理：

在己糖激酶催化的反應(yīng)中，葡萄糖被三磷酸腺苷(ATP)磷酸化。然后，在氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)存在下，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)催化的反應(yīng)中，將6-磷酸葡萄糖(G6P)氧化為6-磷酸葡萄糖酸。在該氧化過程中，等分子量的NAD被還原為NADH。因此在340nm處吸光度的增加與葡萄糖濃度成正比。

注意事項(xiàng)和免責(zé)聲明：

本試劑僅供科研使用，不能用于藥品、家庭以及其他用途。有關(guān)危險(xiǎn)和安全操作規(guī)程的信息，請(qǐng)參閱安全數(shù)據(jù)表。

試劑盒組成：

1、葡萄糖(HK)檢測(cè)酶試劑

• 用20ml水溶解小瓶?jī)?nèi)粉劑。

• 加水后，立即蓋緊瓶塞，并反轉(zhuǎn)混勻數(shù)次。

• 不可震動(dòng)。

• 加20ml水溶解后，每瓶溶液含有1.5 mM NAD，1.0 mM ATP，1.0 U/ml G6PDH；并含有防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀。

小瓶粉劑保存于2-8℃。出現(xiàn)以下情況應(yīng)丟棄試劑：

• 小瓶粉劑受潮結(jié)塊。

• 加水后不能充分溶解。

• 水溶液出現(xiàn)渾濁。

在沒有可見的微生物生長(zhǎng)的情況下，試劑水溶液比較穩(wěn)定。在18–26℃下保存7天，在2–8℃下至少保存4周。以水作為空白參照，如果新配制的溶液在340nm處的吸光度大于0.350，則該試劑溶液不適合使用。

2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

• D-葡萄糖，1.0 mg/mL溶于0.1%的苯甲酸。

• 即用型標(biāo)準(zhǔn)溶液，符合NIST(美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所標(biāo)準(zhǔn))標(biāo)準(zhǔn)。

• 在2-8℃穩(wěn)定至少六個(gè)月。

• 如果出現(xiàn)混濁，請(qǐng)丟棄。

儀器：

1、分光光度計(jì)：可在340nm下測(cè)定吸光度。

2、量杯。

3、移液器：能夠準(zhǔn)確分配10 μL至1.0 mL的體積。

操作步驟：

樣品制備：

液體：

• 用去離子水將樣品稀釋至葡萄糖濃度為0.05-5mg/mL。

• 如有必要，對(duì)溶液進(jìn)行過濾或去蛋白處理以使其澄清。

• 樣品葡萄糖含量較低且顏色較深時(shí)，應(yīng)予以脫色處理。

• 含碳酸或發(fā)酵樣品，須脫氣處理。

固體：

• 稱量0.1mg樣品。

• 用去離子水提取樣品。可以將溶液加熱(<75℃)以幫助萃取。

• 用去離子水稀釋提取液品至葡萄糖濃度為0.05-5mg/mL。

• 如有必要，對(duì)溶液進(jìn)行過濾或去蛋白處理以使其澄清。

測(cè)定

• 吸取相當(dāng)于0.5-50μg葡萄糖的溶液。

• 為使ΔA340在0.03-1.6之間，必要時(shí)可重復(fù)測(cè)定并改變?nèi)芤后w積。

• 將以下溶液吸取到相應(yīng)的試管中。

• 混勻各試管，在室溫(18-35℃)下孵育15分鐘。

• 用去離子水調(diào)零，測(cè)量340nm吸光度。

計(jì)算

總空白必須考慮到樣品和葡萄糖測(cè)定試劑對(duì)吸光度的影響。

 A_{Total Blank} = A_{Sample Blank} + A_{Reagent Blank}

 ΔA = A_Test –A_{Total Blank}

TV = 總檢測(cè)體積 (mL)

SV = 樣品體積 (mL)

葡萄糖分子量 = 180.2 g/mole 或等效于 180.2 g/moles

F = 制樣稀釋倍數(shù)

ε= NADH 在340nm處的毫摩爾消光系【毫摩爾^-1 cm^-1 或等效于 (mL/μmoles)(1/cm)】

d = 光徑 (cm) = 1 cm

1,000 = 微克到毫克的換算系數(shù)

參考文獻(xiàn)：

1、Bondar, R.J.L., and Mead, D.C., Clin、Chem., 20(5), 586-590 (1974).

2、Kunsst, A、et al., Methods of Enzymatic Analysis, 3rd Edition (H.U、Bergmeyer, ed.)、Academic Press (New York, NY), Vol、2, pp、163-172 (1984).

3、Southgate, D.A.T., Determination of Food Carbohydrates、Applied Science Publishers (London, UK: 1976).

4、Cheng, Y.-S、et al., PLoS Genet., 11(10), e1005561 (2015).

5、Chen, J.-R、et al., Endocrinology, 157(11), 4172-4183 (2016).

6、Chen, Q、et al., J、Biotech., 263, 30-35 (2017).